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抽提离心机的使用方法

【研究背景】

土壤是微生物栖居的主要场所。微生物在土壤中的分布及生命活动与土壤肥力、植物营养、植物病害和植被状况等密切相关。微生物是生态系统的重要组成部分,推动着能量流动和物质循环,在生物地球化学循环中扮演着重要的角色,许多酶和抗生素等生物活性物质均来自于微生物。据统计,每克土壤约含有107个微生物细胞,但用传统技术培养的微生物仅占微生物总数的0.01%~10%而大部分微生物处于不可培养的状态,因此,相当多的菌种由于无法培养而不能被充分的开发和利用。另外,土壤微生物对所生存的微环境十分敏感,是常用的土壤生态系统变化的预警及敏感指标。将近些年发展起来的分子生物学技术(如PCR-DGGE、ARDRA、RFLP等)运用到土壤微生物生态学的研究,可避开传统的微生物分离培养过程,直接探讨土壤中微生物的多样性变化及其与环境的关系,克服因土壤微生物可培养性的差异引起的分析偏差。这些分子生物学方法主要通过提取土壤中微生物总DNA,并对特定DNA序列(如16S rDNA基因)进行扩增,通过分析扩增产物的多样性来推断微生物群落的多样性。因此,从自然环境土壤中提取高纯度、高质量的微生物总DNA对后续研究都是相当重要的。

【实验器材】

1.实验材料不同生态环境的根际土壤样品。

2.试剂DNA抽提缓冲液(根据提取方法选择)、SDS(十二烷基磺酸钠)、EDTA(乙二胺四乙酸)、DNA Marker、苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)、70%酒精,16S rDNA通用引物。

3.仪器和用具离心机、水浴锅、电泳仪及电泳槽。抽提离心机的使用方法

【实验设计思路】

1.从土壤中提取微生物总DNA

(1)裂解细胞。方法包括:①物理法,如玻璃珠研磨振荡、超声波、微波、冻融、煮沸、研钵研磨等。②化学法,如用表面活性剂SDS、热酚、高盐等。③酶解法,如用裂解酶、溶菌酶、蛋白酶、无色肽酶、链霉蛋白酶等。④联合裂解法,是物理、化学方法的综合利用。

(2)提取核酸。一般采用酚/氯仿/异戊醇抽提法。

(3)核酸的纯化。方法有:①电泳法。在1%低熔点脂糖凝胶中电泳,切下含DNA的凝胶,回收。②分子筛法。用Sephadeex G50和G200纯化核酸。③选择沉淀法。用亚精胺-HCl在低盐条件下沉淀DNA,回收。④商品纯化柱法。

抽提离心机的使用方法

2.总DNA的纯度判断

土壤中含有大量的腐殖酸,因此在提取的过程中会有腐殖酸污染。腐殖酸可以螯合Mg2+,或和DNA、蛋白质发生共价结合,从而抑制酶的活性,影响后续的实验操作。由于腐殖酸在230nm处有个吸收峰,通过估算OD260/OD230值可确定所提取的DNA中腐殖酸的污染程度:OD260/OD230值越高,表明DNA纯度越高;反之,腐殖酸污染越严重。由于蛋白质在280nm处有个吸收峰,通过估算OD260/OD280值可确定DNA中蛋白质的污染程度:纯的DNA的OD260/OD280值为1.8;越接近1.8表明DNA越纯;小于1.8表示有蛋白质或酚污染。

3.总DNA直接用于PCR扩增为了验证提取的DNA是否含有杂质,以细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增,能直接扩增到16S rDNA片段,说明提取的DNA比较纯,可以直接用于后续操作。

【研究目标】

(1)建立一种适合的土壤微生物总DNA的提取方法。

(2)提取的DNA质量达到可直接用于PCR分析的要求。抽提离心机的使用方法

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