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离心机工作曲线

化妆品中激素类成分的检测方法

Determination of Hormone Components in Cosmetics

1 范围

本方法规定了采用高效液相色谱-质谱法测定化妆品中的激素类成分,包括定性与定量。

本方法适用于膏霜乳液类、液态水基类、液态油基类、凝胶类、面膜类等化妆品中激素类成分的定性与定量。

2 方法提要

样品以乙腈为溶剂提取,采用高效液相色谱仪分离,质谱检测器检测,根据保留时间和特征离子对的相对丰度比定性、定量离子对峰面积定量,以标准曲线法计算含量。

本方法对63种激素类成分的检出限、定量下限和取样量为0.2 g时的检出浓度、最低定量浓度见表1。

表1 63种激素类成分的检出限、定量下限、检出浓度和最低定量浓度

3 试剂和材料

除另有规定外,本方法所用试剂均为分析纯或以上规格,水为GB/T 6682规定的一级水。

3.1 乙腈:色谱纯。

3.2 正己烷:色谱纯。

3.3 50%乙腈溶液:取乙腈、水等体积混合,摇匀。

3.4 70%乙腈溶液:取乙腈、水按体积比7:3混合,摇匀。

3.5流动相的配制:离心机工作曲线

流动相A:水

流动相B:乙腈(3.1)

3.6标准储备溶液

分别称取各激素标准品(表1)10 mg(精确到0.00001 g)置于50 mL容量瓶中,加乙腈(3.1)使溶解并定容至刻度。

4 仪器和设备

4.1液相色谱-三重四极杆质谱联用仪。

4.2分析天平。

4.3离心机。

4.4超声波清洗仪。

4.5涡旋混合仪。

5 分析步骤

5.1混合标准溶液的制备

分别取各激素标准储备溶液(3.6)适量,用50%乙腈溶液(3.3)配制成浓度在定量下限附近的溶液。

注:实验室完成分析方法的优化后,如能够保持仪器、色谱条件、质谱测定参数等分析条件固定,测定指标重现性良好,可随行质控标准品溶液代替63种激素混合标准品溶液对分析条件的稳定性、结果的重复性进行控制。如发生更改仪器、色谱条件、质谱条件等情况,均需重新对各组分进行定位。

质控标准储备溶液:称取曲安奈德、卤美他松、哈西奈德、地塞米松、地塞米松醋酸酯、氟氢缩松、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯、环索奈德、雌二醇、己烯雌酚标准品各约10 mg(精确到0.00001 g)置于100 mL容量瓶中,用乙腈(3.1)溶解并定容至刻度,作为质控标准储备液。置-20℃保存。对于质谱响应较弱的成分,实验室可自行增加该成分作为质控标准物质,以提高筛查准确性。

离心机工作曲线

质控标准混合溶液:分别量取质控标准储备溶液适量,用50%乙腈溶液(3.3)配制成浓度在定量下限附近的溶液。

5.2 样品处理

5.2.1 膏霜乳液类、液态水基类、凝胶类、面膜类样品

称取样品0.2 g(精确到0.001g),置于10 mL具塞比色管中,加入少量乙腈(3.1),在涡旋混合仪上振荡30s至试样与提取溶剂混合均匀,然后加入乙腈至近刻度,超声提取20 min,静置至室温,用乙腈(3.1)定容至刻度,摇匀,以4000 r/min离心10 min,滤过(必要时取上清液适量用50%乙腈溶液(3.3)稀释,稀释液经0.22 μm滤膜过滤),滤液作为待测溶液。

5.2.2 液态油基类

称取样品0.2 g(精确至0.001g),置于离心管中,加入2 mL正己烷(3.2),在涡旋混合仪上分散,然后加入70%乙腈(3.4)3 mL,涡旋振荡2 min,4000 r/min离心10 min,吸取下层溶液至10 mL比色管中,上层正己烷层用70%乙腈(3.4)3 mL,自“涡旋振荡2 min,…”起,重复上述步骤一次,合并两次溶液,加50%乙腈(3.3)定容至刻度,滤过(必要时用适量50%乙腈溶液(3.3)稀释,稀释液经0.22 μm滤膜过滤),滤液作为待测溶液。

5.3仪器参考条件

5.3.1 参考色谱条件

色谱柱: C18柱 (150 ×2.0 mm,2.2 μm),或等效色谱柱。

流动相梯度洗脱程序:

流速:0.3 mL/min;

柱温:40 ℃;

进样量:10 μL;

5.3.2 质谱条件

离子源: 电喷雾离子源(ESI源);

离心机工作曲线

监测模式: 正离子、负离子多离子反应监测模式,监测离子对及相关参数设定见表2。

表2 63种激素类成分监测离子对及相关参数设定表

注:“*”为定量离子对

5.4 定性

取待测溶液与标准溶液在相同分析条件下测定,样品中如呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰,被测成分的特征离子峰保留时间与标准溶液对应的保留时间一致,且选择的定性离子的相对丰度比与相当浓度标准品溶液的定性离子的相对丰度比的最大偏差不超过表3的规定,则可以判定样品中存在对应的激素成分。

注:如使用质控标准混合溶液,应满足以下质控条件:①各成分均检出相应的特征离子对,②特征离子对信噪比SN≥7,③保留时间相对偏差在±3%内。当样品中检出疑似阳性成分时,应随行相应的标准溶液进行确证。

表3 定性判定时离子相对丰度的最大允许偏差

5.5 定量

5.5.1 标准储备溶液的制备

称取待测激素标准品约10mg(精确到0.00001 g),置100 mL容量瓶中,用乙腈(3.1)使溶解并定容至刻度。

5.5.2系列基质标准溶液的制备

取与待测样品基质类型相同空白样品6份于10 mL比色管中(0.2 g/份),分别加入标准储备溶液适量,按照“5.2样品处理”的操作步骤处理,然后用50%乙腈溶液(3.3)配制系列基质标准溶液。其中氟氢缩松、卤美他松、哈西奈德、雌二醇、雌三醇、雌酮浓度为6、10、20、30、40、60 ng/mL,其余组分浓度为 2、4、10、20、40、60 ng/mL(标准溶液浓度范围可根据实际情况进行调整)。

5.5.3 样品处理:同5.2

5.5.4 测定

离心机工作曲线

取系列基质标准溶液依次进样,记录定量离子对色谱峰面积并绘制峰面积(A)-浓度(C)标准曲线,其线性相关系数r≥0.99。取待测溶液进样,测得定量离子色谱峰面积,根据标准曲线得到待测溶液中各成分的浓度,按“6”计算样品中各成分的含量。

6分析结果的表述

6.1计算

式中: ω——样品中激素类组分的质量分数,g/g;

ρ——从标准曲线得到待测组分的质量浓度,g/mL;

V——样品定容体积,mL;

m——样品取样量,g;

D——稀释倍数(如未稀释则为1)。

在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15 %。

6.2 回收率和精密度

多家实验室验证定量下限浓度回收率为72.7~122.1%,相对标准偏差小于15%(n=6),其他浓度回收率为80.7~119.6%,相对标准偏差小于11%(n=6)。

附录A

(资料性附录)

离心机工作曲线

63种激素的中文名称、英文名称、CAS号及分子式

(来源:国家药监局;编发:北京天健华成国际投资顾问有限公司化妆品注册部)

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